فلوسایتومتری (Flow-cytometry)

فلوسایتومتری (Flow-cytometry) تکنولوژی آزمایشگاهی برگرفته از مفهوم اندازه­ گیری (measurement) سلول (cell) در جریان مایع (Fluid) است. این تکنیک بر پایه لیزر بوده که از آن جهت شناسائی و بررسی خصوصیات فیزیکی و شیمیائی سلول­ها و ذرات استفاده می­شود. در طول فرآیند، نمونه ای از سلول ها یا ذرات در مایع معلق می شود و به دستگاه فلوسایتومتر تزریق می­شود.

مهمترین برتری این روش آن است که تقریباً ده هزار سلول را از نظر وجود مارکرهای مختلف (حداقل 4 نوع) می توان در کمتر از یک دقیقه توسط رایانه تجزیه و تحلیل، طبقه بندی و پردازش کرد. از فلوسایتومتری معمولاً برای ارزیابی مغز استخوان، خون محیطی و سایر مایعات در بدن استفاده می ­شود.

تکنسین های آزمایشگاه یا پاتولوژیست ها فلوسیتومتری را انجام می دهند. این آزمایش به نمونه ای از خون، مغز استخوان، بافت یا سایر مایعات بدن نیاز دارد. نمونه ی خون میتواند در همان آزمایشگاه انجام دهنده تکنیک فلوسایتومتری اخذ شود اما نمونه های تخصصی مانند سایر مایعات بدن (پلور، آسیت و …) و نیز مغزاستخوان حتما بایستی توسط پزشک متخصص و یا فوق تخصص گرفته شود.

بطور خلاصه، نمونه خون، مغز استخوان یا سلول های بافتی در یک سوسپانسیون قرار گرفته، با استفاده از روش اختصاصی با رنگ های فلورسنت (آنتی بادی های منوکلونال کونژوگه شده با رنگ فلورسنت) رنگ آمیزی شده و به دستگاه فلوسایتومتر تزریق می شود. سلول ها مطابق قوانین هیدرودینامیک دستگاه بصورت خطی ردیف شده و سپس از مقابل پرتو لیزر، نور پراکنده و نور فلورسنت عبور می کنند. در نهایت سلول ها توسط دستگاه شمارش و دسته بندی می شوند.

داده ها در کامپیوتر ذخیره شده و از طریق هیستوگرام یا نمودار نقطه ای توسط آزمایشگاه آنالیز و گزارش می شوند. بدین ترتیب، آزمایشگاه نتایج فلوسیتومتری شما را تفسیر می کند و یافته های خود را در یک گزارش آزمایشگاهی جامع قرار می دهد. آزمایشگاه نتایج تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری و همچنین سابقه پزشکی، علائم و آخرین معاینه فیزیکی بیمار را در نظر می گیرد و به همین دلیل اخذ شرح حال، سوابق بیمار و نتایج سایر آزمایشات توسط آزمایشگاه رایج است.

به طور خاص، فلوسیتومتری برای اهداف مختلفی توسط پزشک متخصص درخواست و استفاده می شود، از جمله: شمارش سلول، تعیین نوع سلول، تعیین عملکرد سلول، تعیین خصوصیات سلولی، شناسایی میکروارگانیسم ها مانند باکتری، قارچ یا مخمر، یافتن نشانگرهای زیستی (خصوصیاتی که عملکرد طبیعی را نشان می دهد)، تشخیص و پیگیری درمان بالقوه سرطان­های خون و مغز استخوان. فلوسیتومتری ممکن است برای مشخص کردن و شمارش انواع گلبول‌های سفید خون در ارزیابی بیماری‌های عفونی، اختلالات خود ایمنی یا نقص ایمنی استفاده شود.

همچنین برای تشخیص و طبقه بندی لوسمی یا لنفوم استفاده می شود. فلوسیتومتری معمولاً به عنوان آزمایش بعدی پس از شمارش کامل خون (CBC) یا شمارش افتراقی گلبول های سفید (WBC) استفاده می شود.

این امر به ویژه در صورتی صادق است که آزمایش اولیه افزایش تعداد لنفوسیت ها، تعداد سلول های غیر طبیعی یا وجود سلول های خونی نابالغ را نشان دهد پزشکان متخصص و فوق تخصص از فلوسیتومتری برای پیش بینی میزان تهاجمی بودن سرطان و کمک به تعیین اینکه آیا سرطان به درمان خاصی پاسخ می دهد یا خیر، استفاده می کنند. همچنین می تواند استفاده از آن در تشخیص عود مجدد بیماری پس از درمان مدنظر قرار گیرد.

فلوسیتومتری ممکن است هر زمان که پزشکان متخصص و فوق تخصص نیاز به کسب اطلاعات بیشتر در مورد سلول های داخل بدن داشته باشند استفاده شود. این نوع آزمایش می تواند ۱) تعداد سلول های ایمنی را بررسی کند، ۲) وضعیت چرخه سلولی را ارزیابی کند، ۳) سلول های سرطانی را شناسایی کند یا ۴) حتی DNA افراد را تجزیه و تحلیل کند. متخصصین و محققان هر زمان که بخواهند درباره پیچیدگی‌های برخی شرایط و بیماری‌ها بیشتر بدانند، از فلوسیتومتری استفاده می‌کنند.

به طور خاص، پزشک متخصص با دریافت گزارش نتایج فلوسایتومتری به نشانگرها (آنتی ژن ها) روی سلول ها نگاه می کند. یک سلول سالم، الگویی از آنتی ژن ها را نشان می دهد که با نوع و بلوغ سلول مطابقت دارد. یک سلول غیر طبیعی الگوهای مختلفی را نشان می دهد که ممکن است وجود لوسمی، لنفوم یا سایر بیماری ها را نشان دهد. نتایج غیر طبیعی معمولاً در حضور موارد زیر مشاهده می شود:

لوسمی حاد: نوعی سرطان خون است که در آن مغز استخوان تعداد زیادی سلول خونی غیرطبیعی می سازد. لوسمی ممکن است گلبول های قرمز، گلبول های سفید و پلاکت ها را تحت تاثیر قرار دهد. لوسمی حاد بر اساس نشانگرهای سطحی سلول به لوسمی حاد لنفوئیدی سلول B (B-ALL)، لنفوئیدی سلول T (T-ALL) و میلوئیدی (AML) تقسیم بندی می شود.

در لوسمی میلوئیدی حاد (AML)، ارزیابی فلوسایتومتری مارکرهای CD₁₃، CD₃₃، CD₁₁₇، CD₆₅ و Anti-MPO برای تشخیص، تعیین زیر گروهها (M0-M5)، سیر بیماری و درمان مورد نیاز هستند. در لوسمی لنفوئیدی حاد (ALL) سلول­های B، ارزیابی فلوسایتومتری مارکرهای CD₁₀، CD₁₉، CD₂₀، CD₂₂، CD₂₃، CD₂₅، CD_79a و TdT معمولا برای تشخیص انجام میشود که علاوه بر این ها ممکن است sIgG، sIgM و زنجیره­های سبک kappa و Lambda نیز جهت تایید مورد نیاز باشند. در لوسمی لنفوئیدی حاد (ALL) سلول­های T، ارزیابی فلوسایتومتری مارکرهای CD₂، CD₃، CD₄، CD₅، CD₆، CD₇ و TdT ضروری هستند.

سندرم میلودیسپلاستیک: شامل یک گروه ناهمگن از بیماری های سلولهای بنیادی خون ساز با دوره های بالینی متغیر است که با دیسپلازی یک یا چند نوع سلول خونی و همچنین سیتوپنی و ناهنجاری های عملکردی در دودمانهای مغز استخوان مشخص می شود. MDS یک اختلال کلونال پیشرونده است که بیشتر مردان بالغ بین 60 تا ۷۰ سال را تحت تاثیر قرار می دهد.

این بیماری به عنوان کم خونی مقاوم به درمان شروع می شود که ممکن است به مرحله بلاستیک یا حتی لوسمی میلوئید حاد (AML) پیشرفت کند. ارزیابی فلوسایتومتری CD₄₅، CD₃₄، CD₁₁₇، HLA-DR و CD₁₂₃ برای سلول های پیش ساز میلوئیدی (میلوبلاست ها) آنها را از سایر جمعیتهای سلولی، مانند سلولهای بنیادی خونساز، پیش سازهای سلول B، مونوبلاستها، بازوفیل ها، اریتروبلاست ها و سلول های دندریتیک پلاسما سایتوئید متمایز میکنند.

بیماری لنفوپرولیفراتیو سلول­های B: بیماریهای نسبتاً شایعی هستند که می توانند بصورت مزمن و یا تهاجمی تر باشند. تشخیص این دسته معمولا متعاقب مشاهده غدد لنفاوی بزرگ (LN) یا طحال، آستنی و سیتوپنی یا حتی به طور تصادفی به عنوان لنفوسیتوز در یک شمارش معمول خون محیطی (PB) خون کامل (CBC) صورت میگیرد.

بررسی مورفولوژیکی به عنوان اولین یافته آزمایشگاهی است که چنین وضعیتی را نشان می دهد، که نشان دهنده افزایش درصد و/یا عدد مطلق و/یا لنفوسیت های غیر طبیعی میباشد. این امر باعث بررسیهای بیشتر ایمونوفنوتیپی با استفاده از فلوسیتومتری می شود که در بیشتر موارد، حضور سلول های B مونوتیپی را نشان می دهد.

بنابراین، فلوسیتومتری چند پارامتری نقش مهمی در تشخیص و شناسایی LPDهای سلول B با درگیری PB و/یا مغز استخوان (BM) دارد. ارزیابی فلوسایتومتری CD₁₉، CD₂₀، CD₁₀ لنفوسیتها و تقسیم بندی بر اساس CD₅ همراه با ایمنوگلبولینهای سطحی برای پزشک در تشخیص صحیح ضروری هستند.

لوسمی مزمن: حالتی از لوسمی است که شدت کمتری داشته و پیشرفت کندتری دارد. شایع ترین نوع لوسمی B-CLL است که با تظاهراتی مانند لنفادنوپاتی، لنفوسیتوز خون محیطی و مغز استخوان شناخته میشود. در بیماران با B-CLL، بررسی فلوسایتومتری مارکرهای CD₁₉، CD₂₀، CD₂₂، CD₂₃، CD₂₅، CD₅، CD₄₃ و برخی ایمنوگلبولینهای سطحی سلول انجام میشود.

در لوسمی میلوئیدی مزمن (CML) با هپاتواسپلینومگالی، خونسازی خارج مغزاستخوانی، افزایش تکثیر سلولهای رده میلوئیدی و شناسائی سلولهای نابالغ در خون محیطی آغاز میشود. پس از ورود بیماری به مرحله بلاستیک، از نظر سایتولوژی، فنوتایپ و ویژگیهای بالینی CML از AML قابل افتراق نخواهد بود.

فلوسایتومتری سلول­های بیماران از نظر CD₃₃، CD₁₀، CD₇ و CD₃₄ جهت تشخیص CML درخواست میشود. جهت افتراق انواع CML میتوان از مارکرهای فلوسایتومتری CD₁₃، CD₁₅ و CD₁₆ (نوتروفیلها) CD₃₈ (بازوفیلها) و غیره نیز استفاده کرد.

هموگلوبینوری حمله ای شبانه (PNH): یک اختلال خونی نادر است و زمانی اتفاق می‌افتد که بخشی از سیستم ایمنی بدن به گلبول‌های قرمز خون و پلاکت‌ها آسیب می‌زند.

در صورت عدم درمان، PNH می تواند باعث کم خونی همولیتیک، بیماری مزمن کلیوی یا ترومبوز (لخته شدن خون) شود. در هموگلوبینوری شبانه حمله ای (PNH)، یک جمعیت سلول های بنیادی مغز استخوان تغییر یافته و غیرطبیعی باعث ایجاد سلول های خونساز بالغی در گردش خون می شود که فاقد بیان برخی پروتئین های سطح سلولی است که ویژگی مشترک آن ها پیوند آنها با غشای سلول از طریق یک گلیکوزیل-فسفاتیدیل-اینوزیتول (GPI) است. کمبود GPI به راحتی در سلول های اریتروئیدی، گرانولوسیتی و مونوسیتی ارزیابی می شود و فلوسیتومتری روش انتخابی برای تشخیص آنها است.

روش فلوسایتومتری از دست دادن بیان آنتی ژن های مرتبط با GPI زیر را ارزیابی می کند: CD₅₉ روی گلبول های قرمز، CD₁₄ و FLAER روی مونوسیت ها و نیز CD₂₄ و FLAER روی گرانولوسیت ها.

نقائص ایمنی (Immunodeficiency): اختلالات نقص ایمنی توانایی سیستم ایمنی را برای دفاع از بدن در برابر عوامل خارجی یا غیر طبیعی که به بدن آن حمله می کنند (مانند باکتری ها، ویروس ها، قارچ ها و سلول های سرطانی) مختل می کند. در نتیجه، عفونت های غیر معمول باکتریایی، ویروسی، قارچی یا لنفوم یا سایر سرطان ها ممکن است در فرد با نقص ایمنی ایجاد شود.

نقائص سیستم ایمنی طیف وسیعی از اختلالات هستند که بر اساس منشا به دو دسته اولیه (Primary) و ثانویه/اکتسابی (Acquired) طبقه بندی میشوند. نقائص اولیه سیستم ایمنی ناشی از نقص ژنتیکی مادرزادی هستند و اکثرا در همان دوران کودکی و پس از تولد بارز میشوند (جدول 1). نقائص ایمنی اکتسابی، ثانویه به دلائل دیگری مشتمل بر ویروس نقص ایمنی اکتسابی (HIV) (رایج ترین)، داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی، شرایط مزمن برخی بیماریها (نظیر سرطانها و دیابت) و ندرتا اشعه درمانی هستند.

جدول 1. بیماریهای نقص سیستم ایمنی اولیه

نوع نقص ایمنی بر اساس بخش درگیر سیستم ایمنی	بیماری ها
نقص ایمنی همورال: اختلالات لنفوسیت های B و محصولات آن ها (آنتی بادی ها)	نقص ایمنی متغیر رایج (CVID)  کمبود یک آنتی بادی خاص (کمبود ایمونوگلوبولین انتخابی)،               مانند کمبود IgA هیپوگاماگلوبولینمی گذرا در دوران نوزادی آگاماگلوبولینمی مرتبط با X
نقص ایمنی سلولی: مشکلات سلول های T (لنفوسیت ها)	کاندیدیازیس پوستی مخاطی مزمن سندرم دی جورج  سندرم لنفوپرولیفراتیو مرتبط با X
نقص ترکیبی ایمنی هومورال و سلولی: مشکلات سلول های B و T	آتاکسی – تلانژکتازی سندرم هیپری ایمونوگلوبولینمی E  نقص ایمنی ترکیبی شدید  سندرم ویسکوت آلدریچ
نقص سلول های فاگوسیتی: مشکل در حرکت یا کشتن فعالیت این سلول ها	سندرم چدیاک هیگاشی (نادر)  بیماری گرانولوماتوز مزمن نوتروپنی ادواری  نقص چسبندگی لکوسیت
نقص یا کمبود پروتئین های کمپلمان	کمبود مهارکننده جزء 1 (C1) (آنژیوادم ارثی)  کمبود C2، C3، C4، C5، C6، C7، C8 و/یا C9

برخی از اختلالات نقص ایمنی طول عمر را کوتاه می کند. برخی دیگر در طول زندگی باقی می مانند، اما بر طول عمر تأثیر نمی گذارند، و تعداد کمی با یا بدون درمان برطرف می شوند.

تشخیص زودهنگام جهت پیشگیری از عفونت و مرگ و میر ناشی از آن در این بیماران ضروری است که با آزمایش خون جهت شمارش گلبول های سفید و نیز شمارش افتراقی آن ها، فلوسیتومتری و تستهای ژنتیکی انجام میشود. تعداد مارکرهای فلوسیتومتری برای تشخیص این بیماریها بسیار وسیع هستند اما از جمله رایج ترین میتوان به CD₃، CD₄، CD₈، CD₁₁، CD₁₅، CD₁₈، CD₆₂ و برخی ایمنوگلبولینهای سطحی سلول اشاره کرد.

ناباروری: ناباروری اولیه (PI) به عنوان ناتوانی زن و یا مرد در باردار شدن پس از یک سال مقاربت منظم بدون استفاده از روشهای پیشگیری از بارداری تعریف می شود. ناباروری یک مشکل جدی است که می تواند زندگی یک زوج را خراب کند. بررسی فلوسایتومتریک فاکتورهای ایمونولوژیک شامل CD₃، CD₄، CD₈، CD₁₆ و CD₅₆ در زنان نابارور برای تشخیص اختلال سلول‌های NK رایج است.

همچنین در مردان بررسی DNA اسپرم و تغییرات آپوپتوتیک ناشی از مرگ سلولی برنامه ریزی شده جهت تشخیص ناباروری ضروری هستند. در این صورت بررسی فلوسایتومتری اندکس فرگمانتاسیون DNA (DFI) و نیز پروتئینهای دخیل مانند p53 و Bcl-2 به تعیین علت و درمان ناباروری کمکهای شایانی میکند.

سندرم اختلال عملکرد پلاکتی: پلاکت ها یکی از اجزای خون هستند که به توقف خونریزی کمک می کنند. در بیماران با اختلال عملکرد پلاکتی، تشکیل لخته خون برای توقف خونریزی دشوارتر از حد طبیعی است. اختلال عملکرد پلاکت را می توان بر اساس اختلالات ارثی (که از والدین منتقل میشود) و اختلالات غیر ارثی دسته بندی کرد. بیماری فون ویلبراند شایع ترین اختلال ارثی مرتبط با پلاکت است.

تعدادی دیگر از اختلالات ارثی نادر وجود دارد که پلاکت ها را تحت تاثیر قرار می دهد، از جمله بیماری گلانزمن، سندرم Wiskott-Aldrich، سندرم Chédiak-Higashi، و سندرم برنارد-Soulier. برخی از این سندرم ها شامل اختلالات پوستی، ناهنجاری در عملکرد سیستم ایمنی و کاهش عملکرد کلیه است.

اختلالات پلاکتی اکتسابی معمولاً به دلیل مواد مخدر و بیماری های خاصی ایجاد می شود. رایج ترین داروهایی که بر عملکرد پلاکت تاثیر می گذارند آسپرین و سایر داروهای ضد التهابی غیر استروئیدی (NSAIDs) به همراه داروهای ضد پلاکت مانند کلوپیدوگرل و داروهای مشابه هستند که برای جلوگیری از سکته مغزی و حملات قلبی استفاده می شوند.

بیماری هایی که می توانند بر عملکرد پلاکت تاثیر بگذارند عبارتند از سیروز، مولتیپل میلوما، بیماری کلیوی و لوپوس اریتماتوز سیستمیک (لوپوس). برخی از افراد ممکن است پس از بای پس قلبی ریوی در طی جراحی قلب باز دچار اختلال عملکرد پلاکتی شوند.

فلوسیتومتری امکان کمی سازی گیرنده های سطح پلاکت و نشانگرهای فعال سازی را در داخل بدن در خون کامل سیترات دار فراهم می کند. مزیت اصلی فلوسایتومتری برای ارزیابی عملکرد پلاکتی این است که فقط به مقدار حداقلی خون و پلاکت به خصوص در کودکان نیاز دارد.

دوم، به دلیل آنالیز تک سلولی مبتنی بر فلوسیتومتری و مستقل از تعداد پلاکت ها، می توان از آن برای بیماران ترومبوسیتوپنی شدید استفاده کرد. سوم، خون کامل بدون سانتریفیوژ برای فلوسیتومتری استفاده می شود که می تواند از فعال شدن پلاکت جلوگیری کند.

از فلوسایتومتری برای ارزیابی بیان گلیکوپروتئین های سطح پلاکت (GP)، از جمله GPIIb/IIIa، GPIb/IX/V، GPIa/IIa، P-سلکتین (CD62p)، CD63، پروتئین غشایی مرتبط با لیزوزومی 1 و مپاکرین استفاده میشود.

منابع:

1. Salem DA, Abd El-Aziz SM. Flowcytometric immunophenotypic profile of acute leukemia: ansoura experience. Indian J Hematol Blood Transfus. 2012 Jun;28(2):89-96. Doi: 10.1007/s12288-011-0110-2. Epub 2011 Sep 21. PMID: 23730015; PMCID: PMC3332273.
2. Bento LC, Correia RP, Pitangueiras Mangueira CL, De Souza Barroso R, Rocha FA, Bacal NS, Marti LC. The Use of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes: A Review. Front Oncol. 2017 Nov 15;7:270. Doi: 10.3389/fonc.2017.00270. PMID: 29188193; PMCID: PMC5694750.
3. Debord C, Wuillème S, Eveillard M, Theisen O, Godon C, Le Bris Y, Béné MC. Flow cytometry in the diagnosis of mature B-cell lymphoproliferative disorders. Int J Lab Hematol. 2020 Jun;42 Suppl 1:113-120. doi: 10.1111/ijlh.13170. PMID: 32543070.
4. Shakerian B, Irvani S, Mostafavi S, Moghtaderi M. Quantitative serum determination of CD3, CD4, CD8, CD16, and CD56 in women with primary infertility: The role of cell-mediated immunity. Turk J Obstet Gynecol. 2022 Sep 23;19(3):242-245. doi: 10.4274/tjod.galenos.2022.47527. PMID: 36149308; PMCID: PMC9511930.
5. Omran HM, Bakhiet M, Ehemann V. Flow Cytometry Detection of Sperm DNA Fragmentation and Apoptotic Markers in the Semen of Infertile Males. Int J Reprod Med. 2021 Jul 17;2021:9531775. doi: 10.1155/2021/9531775. PMID: 34336991; PMCID: PMC8313342.
6. Shen CL, Wu YF. Flow cytometry for evaluating platelet immunophenotyping and function in patients with thrombocytopenia. Tzu Chi Med J. 2022 Jul 26;34(4):381-387. doi: 10.4103/tcmj.tcmj_117_22. PMID: 36578648; PMCID: PMC9791859.